快速無菌檢測儀在生物制藥領域的發展與應用

 近年來，隨著一些創新藥物的出現，經典方法已不能很好地適應新形勢新情況。CAR-T 細胞為近年來創新藥物中的明星品種，是一種特異性細胞免疫治療，將患者自體T 細胞通過基因修飾加上腫瘤特異性的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)，使得被修飾的T細胞能夠靶向識別腫瘤細胞并對其進行攻擊，從而起到治療目的。

與傳統無菌生物制品相比，CAR-T 細胞制品在質量屬性和無菌生產工藝上存在諸多特殊性，其個體差異大、產量少、效期短、臨床需求緊迫，終產品需要快速放行；而在生產過程中，因細胞本身無法過濾除菌，無菌生產工藝要求更高，對過程控制要求也更高。在這類創新藥物工藝的近實時控制和成品快速放行中，耗時的傳統質控方法顯然已不適用，需尋求快速、微量的新方法。這些新方法不少是源自基礎科研、臨床等領域，最初并非按制藥業的要求開發，因此需要經過評價驗證，證明其性能不劣于藥典法定方法后，才能用于創新藥物的質量控制。

無菌檢測是產品質量是細胞治療等領域保證的關鍵檢測項目。基于中國藥典的無菌檢查法需要歷經14天，并且培養期間需要逐日觀察，經過肉眼判讀后記錄結果。具有周期長、手工環節多、人為因素影響大、數據完整性欠缺等不足。隨著科學技術的發展，藥品或治療產品的種類也逐漸豐富起來，尤以短效期藥品和細胞治療產品的出現，將無菌檢測的時間和準確性提高到了一個新的高度，伴隨著藥品記錄與數據管理規范的加強，數據完整性也成為不可忽視的一個問題，這些問題的出現給質量控制部門帶來了新的挑戰。

2010 年后，各國藥典針對微生物檢驗替代方法的評價和驗證推出了一系列指導原則，但在傳統制藥領域，快速替代方法的探索實例相對較少，而實際應用于上市產品的案例目前更屬罕見，業內經驗積累較少；但隨著創新藥品上市，這些快速替代方法將會得到廣泛應用。

藥品無菌檢查是藥品質量中對微生物*的最高要求，任何微生物的存活對于用藥者而言都可能是致命的。近年來屢屢曝出的藥害事件也使無菌制劑的無菌保障問題成為公眾關注的焦點。藥典(1953 年版)就收載了無菌檢查法，在以后的歷次藥典改版中，對培養基種類及質量要求、樣品的分類及檢驗量、檢驗方法等均進行了不斷改進。目前，無菌檢查法仍采用逐日觀察，培養14 d。根據培養管渾濁產生的情況判定樣品是否合格，在執行過程中存在一些問題，如逐日觀察的規定會導致無法及時發現陽性結果，無菌檢查的檢驗結果均為實驗人員手工記錄，實驗結果缺乏一定的可追溯性等。當前，商品化的快速微生物檢查法(RMM)以其快速、操作簡便、準確和檢測結果的可追溯等優點，充分滿足了質量保證所提出的更高要求，同時，也為過程分析技術(PAT)的實現提供了技術上的支撐。

為了適應技術發展的需要，中國藥典也于2010年版在指導原則中收載了替代方法驗證的有關內容。相關的規范性文件的出臺為快速微生物檢查法的評價提供了理論依據和指南支持。

符合中國藥典中無菌檢測替代方法：【9201 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則】

解決問題

1.  自動化每10分鐘檢測一次，24小時連續監測

2.  90%陽性標本可在12小時內被檢測

3.  99%的陽性標本可在36小時內可檢測

4.  平均檢出時間小于10小時

5.  假陽性率小于0.1%

6. 由傳統的14天降低到4天

7. 一個CFU的微生物可以被檢測出

9201 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則有以下4個方面。

目前有兩家快速無菌檢測系統已經被FDA 批準用于細胞治療藥物以及基因治療藥物。在國內，該系統也被用于是否為商業無菌產品的檢驗，全血及成分血的無菌試驗[，以及臨床血液、無菌體液的病原學診斷參照中國藥典2010 版附錄藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則的有關內容，分別考察專屬性、檢測限、重復性以及耐用性這4 個方面與現行版中國藥典無菌檢查法相比是否存在差異。

評價對于單一品種無菌檢查采用快速無菌檢測系統替代藥典無菌檢查法的可行性，為該方法作為產品放行檢驗和過程控制的技術手段提供依據。藥典方法和替代方法實現嚴格厭氧環境的原理是不同的，前者是通過化學手段，而后者是物理手段。因此，在實驗過程中發現，對于嚴格厭氧菌的檢查，替代方法在操作過程中需要保證操作環境的嚴格厭氧。實驗考察了替代方法在2 種操作環境下(普通生物安全環境和嚴格厭氧環境)，生孢梭菌的專屬性試驗結果。試驗結果表明，就培養體系促生長試驗來看，操作環境是否嚴格厭氧對于測定結果沒有影響，但對于樣品存在的專屬性試驗結果影響則十分顯著。分析原因，由于樣品存在的專屬性試驗需要接種10 mL的樣品，在普通操作環境下導入的氧氣量會明顯增多，由于操作環境沒有隔絕氧氣，對試驗結果的影響就會凸顯出來，而當接種量較少時，比如培養體系促生長試驗，這種影響就會被弱化。因此，在進行樣品檢測時，需在厭氧的環境下接種樣品至厭氧瓶，保證嚴格厭氧菌能被有效檢出。驗證結果表明，替代方法與藥典方法基本相當。但是驗證試驗不可能覆蓋所有的微生物，由于2 種方法的培養基體系不*相同，因此不能排除對于某些微生物的促生長能力2 種方法可能不相當。

BD BACTEC FX40 儀器是一種用于檢測臨床樣本中是否存在微生物的自動系統。已植入的瓶放在儀器瓶位中。門關閉后，將通過瓶中專門設計的傳感器測量熒光水平，從而監控瓶中微生物代謝活動隨時間的變化情況。此操作由測量子系統執行。算法子系統分析測量子系統發出的信號以確定是否存在微生物生長（即陽性）證據。攪拌操作由支持有機體生長的攪拌子系統執行。數據存儲和檢查通過數據管理子系統進行管理。如果發生孵化失敗、攪拌故障或測量系統故障等警報條件，瓶位將顯示為不可用。

用戶界面子系統包括與儀器工作流程有關的所有儀器功能：首先將瓶插入到儀器中進行測試、然后移除陽性瓶，最后移除陰性瓶。可以向系統中輸入統計信息并以報告形式輸出。可以通過專為單手操作而設計的條形碼閱讀器輸入瓶信息，也可以通過屏幕鍵盤手動輸入。通過在對瓶進行掃描后立即將該瓶插入到瓶位，可以將瓶與特定的瓶位相關聯；這會激活瓶位的瓶駐留傳感器。您可以查看由儀器處理的瓶的相關信息、請求打印報告或與 EpiCenter 系統通信。儀器前面的 LED 指示燈和每個瓶位上方的其他指示燈可傳遞狀況信息。每個工作流程事務完成時，儀器會提供確認性的音頻和視頻反饋。

可以將 1 至 4 個 BACTEC FX40 儀器連接到單個平板電腦上，并可以共享一臺打印機和條形碼閱讀器。此群集可以連接到一個 BD EpiCenter 系統以形成一個在 BACTEC FX40 群集和 BACTEC FX 儀器之間具有*連接的更大安裝。

快速無菌檢測系統采用簡單轉接、連續震蕩孵育檢測技術，降低了無菌操作污染的風險，實現了檢測結果及時反饋，區別于傳統無菌檢查的繁瑣操作、靜態培養以及人為的濁度判讀法，有其結果報告的實時性、可追溯性以及避免人員干擾的優勢。

替代方法和藥典方法無菌檢查都是基于培養的，因此實驗結果是否為“無菌生長"在一定程度是基于標準規定的培養天數，也就是說14 d“無菌生長"并不一定意味著15 d 仍是“無菌生長"。因此，縮短無菌檢查的培養天數是有風險的。通過替代方法的驗證試驗，可以認為快速無菌檢測系統作為某一具體品種用于過程控制是可行的。

參照 2015 年及 2020 年版中國藥典四部通則<9201>藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則的有關內容，對 BACTEC FX 全自動系統與中國藥典的無菌檢查法進行了系統比較。同時選取特定品種，全面評估 BACTEC FX 全自動系統與中國藥典的無菌檢查法在專屬性、檢測限、重復性以及耐用性是否存在差異。為該品種是否能采用 BACTEC FX 全自動系統進行無菌快速檢測提供依據。

注：文章摘自當前發布的文獻，歡迎咨詢。